生命波人参碳量子点

时间:2020-09-14 09:41:50 来源:互联网112作者:kh

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基于“适应原样”作用的参碳量子点胶体对小鼠抑瘤作研究和抗COVID-19临床应用 张喜武1,田莹莹1,李秋晗1,4,白玉峰2,朱瑜3,窦金金1*

 (1.黑龙江中医药大学,哈尔滨,150040;2.哈尔滨成程生命与物质研究所,哈尔滨,150500;3.哈尔滨团簇现代中医健康服务有限公司,哈尔滨,150500;4.黑龙江省康效中医药研究有限公司,哈尔滨,150040)
 摘要:目的:研究人参碳量子点胶体(G-CQDS)对ICR小鼠移植瘤的抑瘤作用及免疫作用的影响,明确G-CQDS的“适应原样”作用,为在临床上抗COVID-19提供理论依据。方法:采用超音速对撞粉碎和光电碳化技术,制备G-CQDS溶液,选用NCI-H1975肺癌细胞株,建立小鼠肿瘤模型,以外观、肿瘤体积、相对肿瘤增殖率、胸腺指数及免疫因子为考察指标,计算肿瘤体积及相对肿瘤增殖率,应用ELISA法测定小鼠IL-6、TNF-α的含量。结果:G-CQDS溶液中碳颗粒为完整类球形晶体,直径约为2-5nm,具有光致发光性。治疗组给药第10天起相对肿瘤增殖率<60%,预防组成瘤率仅为35%,与模型组比较,肿瘤体积显著减小,并具有统计学意义(P<0.05)。能有效提高TNF-α的含量,降低IL-6水平,提高小鼠免疫力。结论:G-CQDS溶液具有“适应原样”作用,能够抑制ICR小鼠移植瘤生长和提高免疫力的作用,且预防作用大于治疗作用,能为在临床上抗COVID-19有效提供依据。
 关键词:人参碳量子点;免疫调节;抑瘤;COVID-19;适应原样
 Study on Antitumor Effect of Ginseng Carbon Quantum Dot Colloids in Mice Based on "Adaptogen" and Clinical Application of Anti-COVID-19
 Zhang Xiwu 1, Tian Yingying 1, Li Qiuhan 1,4, Bai Yufeng 2, Zhu Yu 3, Dou Jinjin 1*
 (1.Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, 150040; 2. Harbin Chengcheng Institute of Life and Material, Harbin, 150500; 3. Harbin Cluster Modern Chinese Medicine Health Service Co., Ltd., Harbin, 150500; 4. Heilongjiang Kangxiao Traditional Chinese Medicine Research Co., Ltd. Harbin, 150040)
 Abstract: Objective: To study the effect of ginseng carbon quantum dot colloid (G-CQDS) on the antitumor effect and immune effect of transplanted tumors in ICR mice, to clarify the "adaptogen" effect of G-CQDS, and to provide theoretical basis for clinical anti-COVID-19. Methods: G-CQDS solution was prepared using supersonic collision smashing and photoelectric carbonization technology, and NCI-H1975 lung cancer cell line was selected to establish a mouse tumor model. The appearance, tumor volume, relative tumor proliferation rate, and thymus index and immune factors as indicators of investigation. The tumor volume and relative tumor proliferation rate were calculated, and the contents of IL-6 and TNF-α in mice were measured by ELISA method. Results: The carbon particles in G-CQDS solution were complete spherical crystals with a diameter of about 2-5nm, with photoluminescence. Relative tumor proliferation rate <60% from the 10th day of administration in the treatment group, only 35% of the preventive tumor formation rate, compared with the model group, the tumor volume is significantly reduced, and has statistical Significance (P <0.05). It can effectively increase the content of TNF-α, reduce the level of IL-6, and improve the immunity of mice. Conclusion: G-CQDS solution has an "adaptogen" effect, and can inhibit the growth of transplanted tumors and improve immunity in ICR mice , and the preventive effect is greater than the therapeutic effect, can provide evidence for clinically effective anti-COVID-19.
 Keywords: Ginseng carbon quantum dots; Immune regulation; Tumor suppressor; COVID-19; Adaptogen
 
 COVID-19具有高度的传染性,除人与人传染外,更体现在机体脏腑之间的传染,最终导致多脏器受损甚至脏器衰竭,基于此可运用五脏同补的中药或者方剂进行治疗,达到对症治疗的目的。人参为“百草之王”,是一种滋补强壮的药物,2015版《中国药典》记载,人参具有大补元气、生津固发、补脾益肺、安神益智等功效,《神农本草经》中记载,人参具有“主补五脏……除邪气……”的功效,如生脉散可用于新型冠状病毒肺炎恢复期治疗[1]
 G-CQDS是以人参根为原料,采用超音速对撞粉碎和光电碳化技术,制备成人参碳量子点胶体,因其碳化集聚可负载大量电荷,能够进一步提高人参“适应原样”作用。G-CQDS已在市场应用5年之多,具有较强抗肿瘤和提高免疫力作用,现已被黑龙江省科技厅列入创新产品目录。在疫情期间,积极响应国家号召,为多家社区免费赠送了大量的G-CQDS,旨在提高人体免疫力,降低被COVID-19传染的风险,依据使用跟踪表统计结果,目前使用该产品的人群中未有被COVID-19感染者。由于疫情等多因素限制,目前应用到COVID-19确诊患者仅有2例,分别为何道珍(女,42022219791005004X,武汉人,被武汉市第四医院(古田医院)收治,连续服用6天,核酸检测阴性出院)和李志成(男,420104196402010436,武汉人,被武汉市中医医院收治,连续服用7天,治愈出院)。  
     
 1 实验材料与仪器
 1.1材料 SPF级ICR小鼠90只,18-22g,雄性,购于黑龙江中医药大学实验动物中心,动物许可证号: SYXK( 黑) 2015-003。NCI-H1975肺癌细胞,由中国科学院干细胞库提供。
 1.2试药 G-CQDS溶液(生命波人参根饮液:201811190802,95ml),由哈尔滨团簇现代中医健康服务有限公司提供,吉非替尼(181101,0.25g),购自阿斯利康制药有限公司。
 1.3试剂及仪器 RPMI-1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Hyclone公司);胰蛋白酶(美国Hyclone公司);双抗(美国Hyclone公司);磷酸盐缓冲液PBS(北京Biotopped公司);4%台盼蓝(北京雷根生物技术有限公司);IL-6 、TNF-α酶联免疫检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);不锈钢数显卡尺(上海尺喜工量具有限公司);低速离心机,型号:SC-04(安徽中科中佳科学仪器有限公司);二氧化碳培养箱,型号:HF90(上海力申科学仪器有限公司);超净台,型号:BIOsafe12(上海力申科学仪器有限公司);倒置显微镜,型号:CKX41SF(美国Philippines公司)。超音速对撞粉碎仪器(哈尔滨成程生命与物质研究所自制),光电碳化仪器(哈尔滨成程生命与物质研究所自制)
 2 试验方法
 2.1动物模型复制:60只SPF级ICR雄性小鼠皮下注射接种细胞悬液0.1mL,即每只小鼠接种细胞数为5 x106个/只。空白对照组10只SPF级ICR雄性小鼠皮下注射PBS磷酸盐缓冲液 0.1mL。
 2.2 G-CQDS溶液制备与表征:将超音速对撞粉碎仪器氮气流速设置为600m/s,超高速对撞1-2次,将人参根(≤5年生)瞬间粉碎成超细粉末。将粉末与水混合后在光电碳化仪器进行加热,温度为120℃,人参粉末和水的质量比为 1:10,加热时间为180s,远红外线照射速度30/s,使其全部碳化分散于水中形成碳量子点胶体溶液。碳量子点颗粒通过JEM-2100型透射电镜进行观察,测定其外观形态和粒径大小。采用Nicolet 6700型傅立叶变换红外光谱仪测试光谱,评估碳量子点的光学性质,采用荧光光谱仪(F-7000),测定荧光发射光谱图。 
 2.3动物分组及给药:建模后小鼠随机分为G-CQDS治疗组、吉非替尼组、模型组,每组20只;空白组10只,G-CQDS预防组20只。G-CQDS治疗组以30倍浓缩(相当于人每天饮用24瓶)的饮液9.88mL/kg·d灌胃;吉非替尼组0.0325g/kg·d灌胃;模型组、空白组以纯净水灌胃,灌胃剂量均为0.2mL,连续灌胃18天;G-CQDS预防组提前给药34天,剂量同给药组,第35天皮下接种肺癌细胞悬液,继续给药。
 2.4考察指标:
 2.4.1外观观察:观察各组小鼠健康状况、精神状态、食欲、运动、毛发、大便及肿瘤生长情况等。
 2.4.2肿瘤体积(TV):每天测量肿瘤体积(见表1),其中 a为长径,b为短径,肿瘤体积计算公式为肿瘤体积 =1/2ab2
 2.4.3相对肿瘤增殖率( T/C):各组根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积RTV = Vt /V0,其中 V0为分组给药前( 即d0) 的肿瘤体积,Vt 为每次测量时的肿瘤体积。抑瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率( T/C) ,即给药组RTV 与模型对照组 RTV 比值的百分比, T/C >60%为无效,≤60%并经统计学处理 P <0. 05 为有效。(见表2)
 相对肿瘤增殖率= TRTV /CRTV × 100%。
 2.4.4体质量、胸腺指数及脾指数:称量小鼠给药前(即d0)的体质量及最后一次给药后的体质量。最后一次给药后,禁食不禁水,次日将小鼠摘眼球取血,处死,解剖,剥离胸腺、脾脏,称重,计算胸腺指数及脾指数(见表3)。胸腺指数=[小鼠胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)]×10;脾指数=[小鼠脾脏重量(mg)/小鼠体重(g)]×10。
 2.4.5细胞因子IL-6、TNF-α:小鼠摘眼球取血,血静置1-2h,离心,取血清,采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定每组小鼠血清中IL-6(白细胞介素6),采用竞争法(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。(见表4)
 3实验结果
 3.1G-CQDS的制备与表征:
 高分辨电镜照片显示碳颗粒为无内部缺陷的完整晶体,碳量子点呈类球形单分散,直径约为2-5nm,见图a。图b为碳量子点的傅里叶红外光谱,图中3439cm-1处为羟基(-OH)的伸缩振动峰;2923cm-1与1443cm-1处是C-H的特征吸收峰;1725cm-1处为C=O的伸缩振动峰;1235cm-1处的吸收峰表明存在C-O官能团;860 cm-1处表示存在C-C的伸缩振动;625cm-1处表示可能有C-CO-C弯曲振动。图c为激发光波长不变情况下碳量子点的Emission Wavelength发射光谱,测定样品发射出不同波长的荧光,波长为横坐标,以其强度F为纵坐标作图,325nm激发波长下碳原子团簇/纳米碳的荧光光谱,在325nm激发波长下的荧光最大发射波长约为440nm。图d为保持荧光发射波长不变碳原子团簇/纳米碳Excitation Wavelength激发光谱,400nm发射波长下纳米颗粒的激发光谱,在400nm发射波长下最大激发波长约为470nm,说明纳米颗粒表面含有较多-OH和-COOH。

 图 a为采用水热法制备的G-CQDS透射电镜照片,b为石墨脉冲激光辐照制备的人参碳碳量子点胶体红外吸收光谱(傅里叶红外光谱),c为水热法法制备的G-CQDS Emission Wavelength发射光谱,d为水热法制备G-CQDS Excitation Wavelength激发光谱。
 3.2外观观察:观察小鼠外观及生存状态,G-CQDS治疗组及预防组较模型组瘤体小,活泼好动,精神状态良好,食欲良好,毛发光泽,大便性状未见异常;吉非替尼组小鼠瘤体小,行动迟缓、不活泼,食欲欠佳,毛发暗淡无光泽;模型组与给药组相比,瘤体较大;空白组小鼠健康状况及精神状态良好,食欲佳,行动灵活。
 3.3肿瘤体积(TV)

表1  各实验组小鼠肿瘤体积(mm3)

 各组均与模型组相比较,**p<0.01,*p<0.05; n=10
 各组小鼠肿瘤体积如表1所示,吉非替尼和G-CQDS治疗组肿瘤体积较模型组显著减小,随着给药天数的增加,肿瘤体积先增大后减小。建模小鼠成瘤率100%,G-CQDS预防组小鼠成瘤率为35%。
 3.4相对肿瘤增殖率( T/C)

表2  各实验组小鼠相对肿瘤增殖率的影响

 G-CQDS治疗组给药10-13天的相对肿瘤增殖率分别为57.24%、55.00%、28.14%、17.93%,均<60%,吉非替尼组给药第13天相对肿瘤增殖率达到38.65%。
 3.5体质量、胸腺指数及脾指数

表3  各实验组小鼠体质量、胸腺指数、脾指数的影响

 各组均与模型组相比较,**p<0.01,*p<0.05;n=10
 小鼠给药前后体质量的变化如表3所示,G-CQDS治疗组体重增长量与模型组一致,说明G-CQDS对小鼠体重无影响;吉非替尼组体重变化比模型组小,可能与吉非替尼影响小鼠食欲有关;G-CQDS预防组体重变化大,原因可能与给药周期较长有关。
 小鼠胸腺指数、脾指数的测定如表3所示,吉非替尼组较模型组明显降低胸腺指数和脾指数,其中脾指数更为显著;G-CQDS治疗组对小鼠脾指数的影响较大,G-CQDS预防组与模型组比较均能降低胸腺指数和脾指数(p<0.01)。
 3.6细胞因子IL-6、TNF-α检测

表4  各实验组小鼠IL-6、TNF-α的影响

 各组均与模型组相比较,**p<0.01,*p<0.05;n=10

 试剂盒检测结果显示,G-CQDS预防组可以显著降低IL-6的含量,吉非替尼、G-CQDS治疗组及预防组与模型组比较均可升高TNF-α的含量,从而达到抑制肿瘤生长的作用。

 4结论

 G-CQDS治疗组与模型组比较肿瘤体积明显减小,给药第10天起相对肿瘤增殖率<60%,证明G-CQDS具有抗肿瘤作用,且起效速度较快。预防组成瘤率显著降低,且预防组显示出更好的疗效,证实G-CQDS可以有效预防肿瘤形成。能明显降低胸腺指数和脾指数,可能通过调节小鼠免疫功能达到抑制肿瘤生长的目的。G-CQDS治疗组与预防组对小鼠外观和生存状态无任何不良影响,而吉非替尼阳性对照组对模型小鼠外观和生存状态影响较大,推测是由吉非替尼副作用导致的[2,3]

 人参具有“适应原样”作用,能够增强机体对有害因素的抵抗力。临床中医专家认为患者热退后往往存在疲倦、舌少津等症状,表现为气阴两虚证,这也众多专家意见相同[4],提示新冠肺炎患者核酸检测阴性出院后,仍要继续服用人参产品,尽快恢复新冠肺炎对身体造成的损伤。

 超音速对撞粉碎和光电碳化仪器是由哈尔滨成程生命与物质研究所和北京航空航天大学国家重点实验室合作自主研发并制造,其技术水平为国内领先,共耗资几千万元人民币。超音速对撞技术采用高压气体和高速离心加速,将中药粗颗粒以600m/s的速度相向对撞,使其破碎成原子或分子团簇(小于5mm),悬浮在水溶液中。光电碳化技术是高压放电产生的等离子体(弧光或闪电)作用在悬浮于水溶液中的团簇,使其碳化制成碳量子点溶胶的过程(直径约为2-5nm)。 碳量子点(CQDS)是近来出现碳纳米材料家族的新一成员,由于其有荧光稳定性高且耐光漂白、激发光宽而连续、有水溶性好及在细胞中迁移快等特性,被认为是一种理想的生物医用材料[5]。最新研究发现碳量子点具有提高T细胞能力以及诱导人肝癌细胞、骨肉瘤细胞凋亡的现象[6-9],将传统中药制备成以碳量子点形式给药,可大大能够提高临床疗效。

 参考文献

 [1] 田野,李瑞明,任红微,李德坤,鞠爱春,何毅,周水平,闫凯境,余伯阳.生

 脉散用于新型冠状病毒肺炎恢复期治疗的可行性探讨[J/OL].药物评价研究.

 http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1409.R.20200220.0947.002.ht ml

 [2] 吴学刚.吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的疗效和毒副作用观察[J].临床医药文献电子杂志,2018,5(A0):187.

 [3] 隋东江,王蓉美,李伟生,等.吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的疗效和毒副作用观察[J].实用癌症杂志,2014,29(11):1486-1488.

 [4] 张 炜, 吴银根, 张惠勇, 等. «上海市新型冠状病毒感染的肺炎中医诊疗方案(试行)»解读 [J/OL]. 上海中医药杂志, 2020, 1-4. Doi: 10.16305/j.1007-1334.

 2020.03.001.

 [5] LI HT, KANG ZH, Liu Y, et al. Carbon nanodots: synthesis, properties and applications. Journal of Materials Chemistry, 2012, 22(46):24230-24253.

 [6] ZHENG M,  Ruan SB , LIU S, et al. Self-Targeting Fluorescent Carbon Dots for Diagnosis of Brain Cancer Cells[J]. ACS NANO, 2015, 9(11): 11455-11461.

 [7] CHEN XJ,GONG FH, CAO Z,et al. Highly cysteine-selective fluorescent nanoprobes based on ultrabright and directly synthesized carbon quantum dots[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018, 410:2961–2970.

 [8] WU FS , SU HF ,WANG K, et al. Facile synthesis of N-rich carbon quantum dots from porphyrins as efficient probes for bioimaging and biosensing in living cells[J]. International Journal of Nanomedicine, 2017, Volume 12:7375-7391.

 [9] KAUR H , RAJ P , SHARMA H , et al. Highly selective and sensitive fluorescence sensing of nanomolar Zn 2+, ions in aqueous medium using Calix[4]arene passivated Carbon Quantum Dots based on fluorescence enhancement: Real-time monitoring and intracellular investigation[J]. Analytica Chimica Acta, 2018,1009:1-11.

 基金来源:国家自然科学基金面上项目(81703719);中国博士后项目(2018W631);黑龙江省博士后青年英才计划(LBH-TZ1620)

 作者简 介: 张 喜 武 ( 1982—) ,男,博 士,副 研 究 员,硕 士 生 导 师,从 事 纳 米 靶 向 给 药 研 究。Tel: ( 0451) 87266827,E-mail:149772105@ qq.com

 通信作者: 窦金金 ( 1980—),女,博士,副主任医师,硕 士 生 导 师,研究方向为中西医结合防治心血管病。E-mail: doujinjin1980@126.com


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